Welche Methoden gibt es zur Proteinextraktion?

Wie wir alle wissen, ist Protein für den menschlichen Lebensunterhalt unverzichtbar. Viele Nahrungsmittel enthalten Protein und eine normale Ernährung kann den Körper zusätzlich mit Protein versorgen. Tatsächlich hat die Proteintrennungs- und Extraktionstechnologie im Bereich der biochemischen Forschung ein breites Anwendungsspektrum. Es ist nicht einfach, Protein zu extrahieren. Es erfordert viele Prozesse und professionelle Betriebstechniken. Derzeit gibt es die folgenden Methoden zur Proteinextraktion.

1. Ultrazentrifugation

Das Prinzip dieser Methode zur Trennung und Reinigung von Antigenen besteht darin, die unterschiedlichen Sedimentationsraten der einzelnen Partikel in der Gradientenlösung auszunutzen, sodass sich Partikel mit unterschiedlichen Sedimentationsraten in unterschiedlichen Dichtegradientenschichten befinden und so das Ziel der Trennung voneinander erreichen. Zu den häufig verwendeten Dichtegradientenmedien gehören Saccharose, Glycerin, CsCl usw.

Beim Trennen und Reinigen von Antigenen durch Ultrazentrifugation oder Gradientendichtezentrifugation ist es äußerst schwierig, eine bestimmte Antigenkomponente mit Ausnahme einzelner Komponenten zu trennen. Daher wird es nur verwendet, um einige große molekulare Antigene wie IgM, C1q, Thyreoglobulin usw. und einige leichtere Antigensubstanzen wie Apolipoprotein A, B usw. zu trennen. Die meisten Proteine ​​mit mittlerem und niedrigem Molekulargewicht lassen sich mit dieser Methode nur schwer reinigen.

2. Selektive Niederschlagsmethode

Das Prinzip besteht darin, durch die Verwendung verschiedener Fällungsmittel oder durch die Veränderung bestimmter Bedingungen die Ausfällung von Protein-Antigen-Komponenten auf der Grundlage der Unterschiede in den physikalischen und chemischen Eigenschaften jedes Proteins herbeizuführen und so das Ziel der Reinigung zu erreichen. Die am häufigsten angewandte Methode ist das Aussalzen von Niederschlägen.

Prinzip der Aussalzmethode

Die Löslichkeit von Proteinen in wässrigen Lösungen hängt von der Anzahl der Wassermoleküle um die Oberflächenionen der Proteinmoleküle ab, das heißt, sie wird hauptsächlich durch das Ausmaß bestimmt, in dem die hydrophilen Gruppen an der Peripherie der Proteinmoleküle mit Wasser einen Hydratfilm bilden, und durch die Ladung der Proteinmoleküle. Nach der Zugabe von Neutralsalz zur Proteinlösung wird die Hydratschicht um die Proteinmoleküle geschwächt oder verschwindet sogar, da die Affinität von Neutralsalz zu Wassermolekülen größer ist als die von Protein. Gleichzeitig kommt es bei der Zugabe von Neutralsalz zur Proteinlösung zu einer Veränderung der Ionenstärke und damit zu einer weitgehenden Neutralisierung der Ladung auf der Proteinoberfläche, was die Löslichkeit des Proteins weiter verringert und zur Aggregation und Ausfällung der Proteinmoleküle führt. Da verschiedene Proteine ​​eine unterschiedliche Löslichkeit in unterschiedlichen Salzkonzentrationen aufweisen, werden in Salzlösungen unterschiedlicher Sättigung unterschiedliche Proteine ​​gefällt und dadurch von anderen Proteinen getrennt. Die am häufigsten verwendete Salzlösung ist Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 33 % bis 50 %. Die Aussalzmethode ist einfach und bequem und kann zur Grobauszügelung von Proteinantigenen, zur Extraktion von Immunglobulin G, zur Proteinkonzentration usw. verwendet werden. Die Reinheit der mit der Aussalzmethode gereinigten Antigene ist nicht hoch und eignet sich nur zur Vorreinigung von Antigenen.

3. Gelchromatographie

Bei der Gelchromatographie werden Proteine ​​mittels Molekularsiebung getrennt. Gel ist eine Substanz mit einer dreidimensionalen porösen Netzwerkstruktur. Nach dem richtigen Lösungsgleichgewicht wird es in die Chromatographiesäule geladen. Wenn eine Probenlösung mit verschiedenen Molekülen langsam durch eine Gelchromatographiesäule fließt, können makromolekulare Substanzen nicht leicht in die Mikroporen der Gelpartikel eindringen und sich nur zwischen den Partikeln verteilen. Daher bewegen sie sich bei der Elution schneller nach unten und werden zuerst eluiert. Kleine Moleküle können nicht nur in den Zwischenräumen zwischen den Gelpartikeln diffundieren, sondern auch in die Mikroporen der Gelpartikel eindringen, sich bei der Elution langsamer nach unten bewegen und anschließend eluiert werden. Daher werden Proteinmoleküle entsprechend ihrer Molekülgröße getrennt.

4. Ionenaustauschchromatographie

Das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie besteht darin, Zellulose oder Gel mit ionischen Gruppen zu verwenden, um Proteinantigene mit entgegengesetzter Ladung zu adsorbieren und auszutauschen. Da verschiedene Proteine ​​unterschiedliche isoelektrische Punkte haben und eine unterschiedliche Ladungsmenge tragen, ist ihre Fähigkeit, an Zellulose (oder Gel) zu binden, unterschiedlich. Bei der Gradientelution wird die Ionenstärke der mobilen Phase schrittweise erhöht, so dass die hinzugefügten Ionen mit den Proteinen um die Ladungspositionen auf der Zellulose konkurrieren und dadurch die adsorbierten Proteine ​​vom Ionenaustauscher abgelöst werden.

In der Ionenaustauschchromatographie-Technologie werden üblicherweise folgende Ionenaustauscher verwendet:

① Cellulose mit Ionenaustauschergruppen, wie Carboxymethylcellulose (CM) und DEAE-Cellulose

② Vernetztes Dextran, Agarose und Polyacrylamid mit Ionenaustauschergruppen

③Durch Gel synthetisiertes, stark vernetztes Harz.

5. Affinitätschromatographie

Bei der Affinitätschromatographie handelt es sich um eine Chromatographietechnik, die die Biospezifität von Biomakromolekülen, also die spezifische Affinität zwischen Biomakromolekülen, ausnutzt. Beispielsweise besteht eine besondere Affinität zwischen Antigenen und Antikörpern, Enzymen und Enzyminhibitoren (oder Liganden), Enzymproteinen und Coenzymen, Hormonen und Rezeptoren, IgG und Staphylokokkenprotein A (SPA). Beispielsweise kann bei der Reinigung von IgG SPA an einer inerten Festphasenmatrix (wie Spehrose 2B, 4B, 6B usw.) adsorbiert und in einer Chromatographiesäule vorbereitet werden. Wenn die Probe durch die Chromatographiesäule fließt, kann das zu trennende IgG spezifisch an SPA binden, während die anderen Komponenten nicht daran binden können. Nachdem die Chromatographiesäule vollständig eluiert ist, wird die Ionenstärke oder der pH-Wert des Eluenten geändert, um das IgG vom SPA auf der Festphasenmatrix zu trennen, und das zu reinigende IgG kann durch Sammeln des Eluenten gewonnen werden.