Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine häufig verwendete Elektrophoresetechnik, bei der Polyacrylamid-Gel als Trägermedium verwendet wird. Es wird häufig verwendet, um Oligonukleotide und Proteine ​​zu trennen. Es wird häufig als anionisches Reinigungsmittel verwendet und kann als Lösungsvermittler und Texturierungsmittel wirken. Die Rolle des Stapelns wird oft erwähnt, wenn über die Funktion der Gelkonzentration gesprochen wird. Wenn die Konzentration relativ gering ist, ist die Porengröße relativ groß. Im Folgenden erfahren Sie mehr über diesen Aspekt.

Einführung

Wirkprinzip: Polyacrylamid-Gel hat eine Netzwerkstruktur und verfügt über eine Molekularsiebwirkung. Es gibt zwei Formen: native-PAGE und SDS-PAGE. Bei native-PAGE können Proteine ​​während der Elektrophorese intakt bleiben und sich in einem Gradienten nach Molekulargewicht, Form und Ladung des Proteins allmählich trennen.

SDS-PAGE kann Proteine ​​ausschließlich auf Grundlage des Molekulargewichts ihrer Untereinheiten trennen. Die Technologie wurde erstmals 1967 von Shapiro entwickelt. Er fand heraus, dass nach der Zugabe ionischer Detergenzien und starker Reduktionsmittel (SDS, Natriumdodecylsulfat) zum Probenmedium und Acrylamidgel die elektrophoretische Mobilität von Proteinuntereinheiten hauptsächlich von der Größe des Molekulargewichts der Untereinheit abhängt (Ladungsfaktoren können vernachlässigt werden).

Wirkung

SDS ist ein anionisches Detergenz. Als Denaturierungsmittel und Lösungsvermittler kann es die Wasserstoffbrücken innerhalb und zwischen Molekülen aufbrechen, die Moleküle entfalten und die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinmolekülen zerstören. Starke Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol und Dithiothreitol können die Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten aufbrechen. Nach Zugabe von Reduktionsmitteln und SDS zur Probe und zum Gel werden die Moleküle zu Polypeptidketten depolymerisiert. Die depolymerisierten Aminosäureseitenketten verbinden sich mit SDS zu Protein-SDS-Mizellen. Die negative Ladung, die sie tragen, übersteigt die ursprüngliche Ladung des Proteins bei weitem, wodurch die Ladungs- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Molekülen aufgehoben werden.

SDS-PAGE verwendet im Allgemeinen ein diskontinuierliches Puffersystem, das im Vergleich zu einem kontinuierlichen Puffersystem eine höhere Auflösung aufweisen kann.

Die Funktion des konzentrierten Gels ist das Stapeln. Die Gelkonzentration ist gering und die Porengröße groß. Wenn dem konzentrierten Gel eine relativ verdünnte Probe hinzugefügt wird, wird sie durch den Migrationseffekt des großporigen Gels auf eine schmale Zone konzentriert. Wenn TRIS/HCl-Puffer als Probenlösung und Sammelgel ausgewählt wird, wird TRIS/Glycin als Elektrodenlösung ausgewählt. Nach Beginn der Elektrophorese dissoziiert HCl in Chloridionen und Glycin in eine kleine Menge Glycinionen. Proteine ​​sind negativ geladen und bewegen sich daher gemeinsam zur positiven Elektrode. Dabei bewegen sich die Chloridionen am schnellsten, die Glycinionen am langsamsten und die Proteine ​​in der Mitte. Zu Beginn der Elektrophorese ist die Mobilität der Chloridionen am größten und übersteigt die der Proteine, wodurch sich auf der Rückseite ein Bereich mit geringer Leitfähigkeit bildet. Die elektrische Feldstärke ist umgekehrt proportional zum Bereich mit geringer Leitfähigkeit, wodurch eine höhere elektrische Feldstärke erzeugt wird, wodurch sich Proteine ​​und Glycinionen schnell bewegen und eine stabile Schnittstelle bilden, wodurch Proteine ​​sich in der Nähe der beweglichen Schnittstelle aggregieren und zu einer Zwischenschicht kondensieren.

Bei dieser Identifizierungsmethode hängt die Mobilität eines Proteins hauptsächlich von seiner relativen Molekülmasse ab und hat nichts mit seiner Ladung und Molekülform zu tun.